同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响

作     者：李慧仙 朱平 LI Hui-xian;ZHU Ping

作者机构：中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/卫生部天然药物生物合成重点实验室北京100050 

基　　金：国家自然科学基金(31270796) "重大新药创制"国家科技重大专项(2012ZX09301002-001-005) 中央高校基本科研业务费专项资金(2012N06) 

出 版 物：《中国医药生物技术》 (Chinese Medicinal Biotechnology)

年 卷 期：2013年第8卷第4期

页      码：241-246页

摘      要：目的在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的条件下，探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响，并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突变库的构建为例，设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列，并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段，运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆， PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp，此时连接效率最高，其阳性重组率高达90%左右，是常规酶切连接法的3倍。与后者相比，该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率，该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。

主 题 词：定向分子进化 In-Fusion技术 同源区段 高通量克隆 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.001

馆 藏 号：203134916...