环介导等温扩增联合横向侧流试纸(LAMP-LFD)对嗜水气单胞菌快速检测方法的建立

作     者：蔡怡 周前进 陈炯 CAI Yi;ZHOU Qian-jin;HEN Jiong

作者机构：宁波大学浙江宁波315211 

基　　金：国家高技术研究发展计划资助项目(863计划)(2012AA092001) 浙江省重大科技专项重点社会发展资助项目(2013C03045-1) 宁波大学学科资助项目(XKL14D2083 xkzsc1417) 宁波大学2015年度研究生科研创新基金资助项目 

出 版 物：《中国兽医学报》 (Chinese Journal of Veterinary Science)

年 卷 期：2016年第36卷第2期

页      码：256-264页

摘      要：以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因为检测靶标,设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记探针,建立了嗜水气单胞菌的LAMP-LFD快速检测方法。该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成检测。经优化,LAMP最佳反应条件为63℃,反应30min,从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40min,比常规PCR检测缩短近2h。试验结果表明,LAMP-LFD可特异性检出嗜水气单胞菌,对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性;其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2.03×101 CFU/mL或0.81CFU/反应,是常规PCR(以F3/B3为引物)的100倍;可从人工污染1×102 CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌。嗜水气单胞菌(106 CFU)人工感染鲫鱼24h,传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1.2×105 CFU/g和6×103 CFU/g;利用LAMP-LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原;以F3/B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌,表明面对实际感染样品,LAMP-LFD的检测灵敏度优于PCR方法。因此,该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段。

主 题 词：嗜水气单胞菌 环介导等温扩增 横向侧流试纸 促旋酶B亚单位基因 检测 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.16303/j.cnki.1005-4545.2016.02.15

馆 藏 号：203135108...