下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌SKOV3细胞体内外生物学特性的影响

作     者：陈佳 王琪 张玮 李力 Chen Jia;Wang Qi;Zhang Wei;Li Li

作者机构：广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科暨区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室南宁530021 

基　　金：国家自然科学基金(30960404) 广西科学研究与技术开发计划(桂科攻14124004-1-24) 广西自然科学基金(2014GXNSFAA118147)@@@@ National Natural Science Foundation of China,Guangxi Scientific Research and Technological Development Program Topics,Guangxi Natural Science Foundation 

出 版 物：《中华妇产科杂志》 (Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology)

年 卷 期：2016年第51卷第2期

页      码：126-134页

摘      要：目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）SKOV3／DDP细胞体内外生物学特性的影响。方法（1）MTRR基因下调的SKOV3／DDP细胞系的构建及鉴定：设计4个针对MTRR基因不同靶序列的短发夹状RNA（shRNA），分别为U6-GFP-Neo-homo-1106、U6-GFP—Neo-homo-1931、U6-GFP—Neo-homo-419、U6-GFP-Neo—homo-1460，蛋白印迹（western blot）法筛选干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA连接至pSicoR质粒，建立重组慢病毒干扰载体（即pSicoR-1106）并感染SKOV3／DDP细胞，流式细胞仪筛选稳定转染的细胞，逆转录（RT）-PCR技术及western blot法验证转染后细胞中MTRR mRNA和蛋白的表达。（2）体外实验：实验分为3组，重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106、阴性对照质粒pSicoR-NC及包装质粒采用脂质体法分别转染肾上皮细胞系293T细胞，所得病毒上清液感染SKOV3／DDP细胞，所得感染后细胞即为下调MTRR基因的SKOV3／DDP-MTRRi细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）以及阴性对照SKOV3／DDP-NC细胞（SKOV3／DDP-NC组，作为阴性对照）和未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定3组细胞的生长情况及其对顺铂的耐药性[以50％抑制浓度（IC50）表示]；不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成情况，流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期比例。（3）体内实验：将上述3组细胞接种于裸鼠的腹股沟皮下，建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。以2．5mg/kg顺铂腹腔注射（每2天1次，共21次）后，观察3组（每组8只）裸鼠移植瘤的生长情况，采用免疫组化SP法检测3组裸鼠移植瘤组织中MTRR、细胞增殖相关核抗原（Ki-67）蛋白的表达。结果（1western blot法筛选的干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA为U6-GFP-Neo-homo-1106，以此建立重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106，转染SKOV3／DDP细胞后，其MTRRmRNA和蛋白的表达明显减弱，证实下调MTRR基因表达的SKOV3／DDP细胞系构建成功。（2）MTT比色法检测显示，第5天开始，SKOV3／DDP—MTRRi组细胞的生长速度明显慢于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3／DDP组（P〈0．05）；SKOV3／DDP—MTRRi组、SKOV3／DDP-NC组、SKOV3/DDP组细胞对顺铂的IC50分别为4．01、7．90、8．91μg／ml，SKOV3／DDP—MTRRi组明显低于SKOV3／DDP-NC组和SKOV3／DDP组（P〈0．05）。不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测显示，各浓度下SKOV3／DDP-MTRRi组克隆形成个数均明显少于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）；流式细胞仪检测显示，当顺铂浓度为4μg／ml时，SKOV3／***组细胞的GJG。期比例为（72．8±5．0）％，明显高于SKOV3／DDP-NC组及SKOV3／DDP组[分别为（64．4±2．5）％、（64．3±3．0）％，P〈0．05]。（3）裸鼠腹腔内注射顺铂6周后，SKOV3／DDP-MTRRi组、SKOV3／DDP—NC组、SKOV3／DDP组裸鼠移植瘤的体积分别为（97±32）、（168±45）、（173±32）mm^3，移植瘤质量分别为（0．36±0．17）、（1．08±0．17）、（1．11±0．20）g，SKOV3／DDP-MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）。3组移植瘤组织中，MTRR蛋白的阳性表达率分别为2／8、5／8、7／8，Ki-67蛋白的阳性表达率分别为118、6／8、7／8，SKOV3／DDP—MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）。结论MTRR基因表达下调后在体内外均能降低顺铂耐药的卵巢癌SKOV3／DDP细胞的增殖能力，并增加其对顺铂的敏感性。

主 题 词：卵巢肿瘤 细胞系,肿瘤 铁氧化还原蛋白NADP还原酶 顺铂 细胞周期 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2016.02.009

馆 藏 号：203135110...