重组腺病毒载体Ad-LMP-1的构建及其转染MSC后成骨活性

作     者：程志安 刘冬斌 吴燕峰 黄霖 沈慧勇 刘尚礼 CHENG Zhi-an;LIU Dong-bin;WU Yan-feng;HUANG Lin;SHEN Hui-yong;LIU Shang-li

作者机构：广州中医药大学第二附属医院 广东省中医院骨科广东广州510120 佛山市南海区人民医院骨科广东佛山528200 中山大学附属第二医院骨科广东广州510120 

基　　金：广东省自然科学基金(5001761) 2005年国家教育部留学回国人员科研启动基金 

出 版 物：《中山大学学报（医学科学版）》 (Journal of Sun Yat-Sen University:Medical Sciences)

年 卷 期：2010年第31卷第2期

页      码：199-206页

摘      要：【目的】快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响。【方法】从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1。转化TOP10细菌后,挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体。以腺病毒为载体,将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内,检测LMP-1基因在MSC细胞的表达,分别观察转染后实验组与对照组I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况,评价LMP-1基因的成骨能力。【结果】成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证。LMP-1基因能在MSC中高效表达,转然后MSC的I型胶原,碱性磷酸酶、骨钙素的表达明显增强,骨钙结节形成增多。【结论】利用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单,可快捷获得的pAd-LMP-1。pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化,增强其成骨作用。

主 题 词：LIM-1矿化蛋白 间充质干细胞 成骨活性 基因转染 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100101[100101] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2010.0033

馆 藏 号：203136380...