稳定阻断前列腺癌细胞中p65的shRNA基因序列的获得及蔓病毒载体的构建

作     者：郭正辉 黄海 杜涛 林天歆 李海源 许可慰 宁志丰 江春 韩金利 黄健 GUO Zheng-hui;HUANG Hai;DU Tao;LIN Tian-xin;LI Hai-yuan;XU Ke-wei;NING Zhi-feng;JIANG Chun;HAN Jin-li;HUANG Jian

作者机构：中山大学附属第二医院泌尿外科广州510120 

基　　金：广东省自然科学基金资助项目(001356、05100980、05300720) 

出 版 物：《中华实验外科杂志》 (Chinese Journal of Experimental Surgery)

年 卷 期：2010年第27卷第9期

页      码：1311-1314,F0004页

摘      要：目的 获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中核因子[NF-κB（p65）]表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3 3条针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5＇向3＇顺序依次为：酶切位点（BamH Ⅰ）、干扰序列（19bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19 bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoR Ⅰ）.将合成的序列插入空载体pSI H1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time聚合酶链反应（PCR）检测不同序列片段对p65的mRNA抑制效果,通过Western blot检测对p65蛋白表达的抑制效果.从而获得可以稳定高效抑制前列腺癌细胞中p65表达的shRNA序列.结果 设计的3条针对p65的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于p65（NM_021975）的1096～1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTTTT G-3＇.其对前列腺癌细胞株中p65的mRNA的干扰效率为59%,对其蛋白表达的抑制率为81%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中p65表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.

主 题 词：核因子 前列腺癌 RNA干扰 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.09.048

馆 藏 号：203142535...