粉尘螨6类变应原(Derf6)的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

作     者：朱永烽 刘志刚 高波 ZHU Yong-feng;LIU Zhi-gang;GAO Bo

作者机构：深圳大学生命科学学院深圳518060 

基　　金：国家863高技术研究发展计划(No.2002AA214011) 国家自然科学基金(No.30271226 30471505)~~ 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2006年第24卷第4期

页      码：241-246页

摘      要：目的构建粉尘螨6类变应原(Dermatophagoides farinae,Derf6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据Derf6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Derf6基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌(***10),经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Derf6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,经纯化后连接并转化至***10。构建的重组质粒pET24a-Derf6经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至***21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Derf6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Derf6和pET24a-Derf6。SDS-PAGE结果表明Derf6基因在***21(DE3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(Mr)为31000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Westernblotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Derf6。

主 题 词：粉尘螨 Der f6 基因表达 纯化 蛋白质印迹 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 100206[100206] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1000-7423.2006.04.001

馆 藏 号：203142780...