多酶恒温快速扩增技术结合荧光探针快速检测日本血吸虫基因方法的建立

作     者：章乐生 王旗 汪峰峰 朱海 李清越 马晓荷 汪敏 王毓洁 汪天平 操治国 ZHANG Lesheng;WANG Qi;WANG Fengfeng;ZHU Hai;LI Qingyue;MA Xiaohe;WANG Min;WANG Yujie;WANG Tianping;CAO Zhiguo*

作者机构：安徽省血吸虫病防治研究所 

基　　金：安徽省重点研究与开发计划项目(202104j07020001,2022e07020003) 安徽省医疗卫生重点专科资助项目 安徽省第十四批“115”产业创新团队资助项目~~ 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2024年第42卷第4期

页      码：481-486页

摘      要：目的 结合多酶恒温快速扩增技术（MIRA）和荧光探针法，建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法 以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子（SjR2）片段为靶序列，设计并合成3对引物和荧光探针，建立荧光MIRA法反应体系，PCR检测，绘制扩增曲线。比较并筛选扩增效果较好的引物对和探针浓度；通过检测1 fg/μl、5 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl和10 pg/μl等不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA，评价该法的灵敏度；提取卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫基因组DNA，并用荧光MIRA法检测，评价其特异度。耳缘静脉采集兔血，分离血清，制备含1 fg、5 fg、10 fg、100 fg、1 pg和10 pg日本血吸虫成虫DNA的兔模拟阳性血清并进行DNA提取，以荧光MIRA法检测，评估该法检测血清中日本血吸虫靶基因的最低限度。结果 引物对1 (SjR2-1)的扩增效率较高，在反应第22个循环时（11 min）扩增出荧光产物，荧光值最高达170 000；探针量为0.6μl/反应时具有较好的荧光强度和低荧光背景。建立的荧光MIRA法在39℃时第26个循环（13 min）时扩增出荧光产物，检测血吸虫成虫DNA的最低检出限为1 fg/反应。扩增产物电泳显示，血吸虫基因组DNA模板含量为10 pg、1 pg、100 fg、10 fg时，均有电泳条带出现，电泳显示的检测限为10 fg/反应，产物大小为186 bp。仅含有日本血吸虫成虫DNA的反应管出现荧光扩增曲线，检测卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫等基因组DNA未出现明显荧光扩增曲线。不同浓度的血吸虫DNA模拟阳性血清中，DNA含量为1 pg和10 pg时，有阳性扩增曲线出现，最快于第16个循环（8 min内）即出现阳性荧光扩增信号，该法检测模拟阳性血清中血吸虫成虫DNA的最低检测限为1 pg/反应。结论 成功建立了一种检测日本血吸虫特异性基因片段的荧光MIRA法，该法反应快速、敏感性高、特异性强，具有潜在的日本血吸虫病诊断应用价值。

主 题 词：日本血吸虫 多酶恒温快速扩增技术 荧光探针 基因片段 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.12140/j.issn.1000‑7423.2024.04.009

馆 藏 号：203143375...