利用Cas9TX实现非病毒TRAC定点整合制备T细胞

作     者：崔海洋 谭淼 全壮 陈红利 董艳敏 唐立春 CUI Hai-yang;TAN Miao;QUAN Zhuang;CHEN Hong-li;DONG Yan-min;TANG Li-chun

作者机构：北京鼎成肽源生物技术有限公司北京102200 

基　　金：北京鼎成肽源生物技术有限公司自筹(Y6) 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2024年第40卷第9期

页      码：190-197页

摘      要：【目的】Cas9TX是Cas9的变体,能够显著降低基因编辑过程中染色体易位,大幅提升基因编辑的安全性。研究Cas9TX替换Cas9实现基因定点敲入的可行性。【方法】首先,利用His标签蛋白纯化技术制备Cas9TX蛋白,并在细胞水平上通过绘制EC50和核酸酶裂解动力学曲线等进行功能验证。其次,以RNP和dsDNA混合物电转的方式编辑体外激活的T细胞,流式检测定点敲入的效率。最后,探讨了供体模板进行稳定性修饰提升定点敲入效率的可行性。【结果】制备的Cas9TX在T细胞TRAC基因的A、R和S靶点的敲除效率分别为71.8%、81.0%和79.9%,具有与Cas9相当的基因敲除效率。在TRAC 1号外显子分别设计的dsDNA供体模板(2A-GFP编码序列)和ssDNA供体模板(+GTC bp),发现Cas9TX RNP定点敲入两种模板的效率均显著低于Cas9RNP。通过DNA修饰制备防TREX2核酸外切酶降解的供体模板,不能提升Cas9TXRNP定点敲入的效率。【结论】Cas9TX RNP在TRAC三个靶点的基因敲除方面可以替代Cas9RNP使用,但定点整合外源基因的效率约为Cas9RNP的一半。为Cas9TX应用于基因定点敲入提供了重要参考。

主 题 词：Cas9TX 定点整合 RNP dsDNA CRISPR/Cas9 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0321

馆 藏 号：203144160...