新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化

作     者：关海容 孙玉英 袁志宏 张惠丽 梁飞 刘楠 郭斯启 习彩霞 奚永志 GUAN Hai-Rong;SUN Yu-Ying;YUAN Zhi-Hong;ZHANG Hui-Li;LIANG Fei;LIU Nan;GUO Si-Qi;XI Cai-Xia;XI Yong-Zhi

作者机构：军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫学研究室100071 

基　　金：国家自然科学基金资助课题 编号30200111 

出 版 物：《中国实验血液学杂志》 (Journal of Experimental Hematology)

年 卷 期：2006年第14卷第1期

页      码：123-127页

摘      要：为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%。Western-blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。

主 题 词：重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 蛋白纯化 靶向杀伤 生物活性 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 100214[100214] 0836[0836] 090102[090102] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1009-2137.2006.01.028

馆 藏 号：203144956...