基于RAA-CRISPR/Cas13a的禽流感病毒检测方法的建立

作     者：乐翔云 冯之航 樊彦莉 张强 蔡一村 熊炜 王翔 董庆利 李健 薛俊欣 王艳 LE Xiangyun;FENG Zhihang;FAN Yanli;ZHANG Qiang;CAI Yicun;XIONG Wei;WANG Xiang;DONG Qingli;LI Jian;XUE Junxin;WANG Yan

作者机构：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心上海200135 上海理工大学健康科学与工程学院上海200093 

基　　金：上海市“科技创新行动计划”技术标准资助项目(20DZ2200100) 上海市“科技创新行动计划”农业科技领域资助项目(22N31900200) 

出 版 物：《中国兽医学报》 (Chinese Journal of Veterinary Science)

年 卷 期：2024年第44卷第10期

页      码：2153-2158,2171页

摘      要：对NCBI文库公布的120条不同亚型禽流感病毒的M基因序列进行分析,筛选得到一处高保守片段并进行重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification,RAA)引物和crRNA的设计。待测样品先进行RAA核酸扩增,再将扩增产物转移至有规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas13a检测体系中,通过监测该体系中荧光值的变化情况进行结果判定。使用梯度稀释(10^(6)~10^(0)拷贝/μL)的标准阳性质粒以及其他7种禽病病毒验证方法的灵敏度和特异性,并利用本试验所建方法和国标荧光RT-PCR方法对50份临床样品(21份阳性样品、29份阴性样品)进行检测以评价方法的检测性能。结果显示,本试验建立的检测方法灵敏度为10^(2)拷贝/μL,较普通RAA方法灵敏度提高了2个数量级;能特异性检出AIV,不与NDV、IBV、ILTV、IBDV、ALV、AMPV、AAV-1发生交叉反应;与国标荧光RT-PCR方法相比,该方法检测的特异性、准确性和一致性分别为100%、95.24%和98.00%。结果表明,本试验建立了检测AIV通用型的RAA-CRISPR/Cas13a快速诊断技术,其在37℃条件下60 min内即可完成检测,具有快速、灵敏、特异等优势,为AIV的现场快速检测提供了手段。

主 题 词：禽流感病毒 RAA CRISPR/Cas13a 

学科分类：090601[090601] 1002[医学-临床医学类] 09[农学] 0906[农学-水产类] 100201[100201] 10[医学] 

D　O　I：10.16303/j.cnki.1005-4545.2024.10.10

馆 藏 号：203145671...