靶向小鼠TNF-α基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

作     者：赵颖杰 王吉波 辛苗苗 梁宏达 刘相萍 杨堃 隋爱华 ZHAO Ying-Jie;WANG Ji-Bo;XIN Miao-Miao;LIANG Hong-Da;LIU Xiang-Ping;YANG Kun;SUI Ai-Hua

作者机构：青岛大学附属医院风湿免疫科青岛266003 青岛大学附属医院中心实验室青岛266071 

基　　金：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目(2006BS03005) 

出 版 物：《中国免疫学杂志》 (Chinese Journal of Immunology)

年 卷 期：2014年第30卷第7期

页      码：927-932页

摘      要：目的:构建靶向小鼠TNF-α基因的RNA干扰慢病毒载体,为RNA干扰基因治疗提供基础。方法:设计、合成3组靶向TNF-α基因的特异小干扰RNA(siRNA):siRNA1、siRNA2、siRNA3及阴性对照siRNA,体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用real-time PCR和ELISA法检测其对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的影响。筛选出特异且抑制性高的siRNA,根据其序列设计合成寡核苷酸链,构建表达短发卡RNA(shRNA)的重组慢病毒质粒并测序,经鉴定质粒与包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,计算病毒颗粒滴度。结果:①siRNA1、siRNA2、siRNA3组的TNF-αmRNA相对表达量分别为0.24±0.01、0.16±0.02、0.19±0.01,与阴性对照0.95±0.02相比差别均具有统计学意义(F=531.3,P0.05;F=0.739,P=0.586 7>0.05)。②siRNA1、siRNA2、siRNA3的TNF-α蛋白表达分别为(23.95±1.21)、(17.27±1.46)、(19.07±1.57)ng/ml与阴性对照的(35.37±2.93)ng/ml相比,差别均具有统计学意义(F=18.1,P=0.000 6<0.001);与阴性对照相比,TNF-α蛋白表达抑制率分别为32.29%、51.16%、46.08%。③以siRNA2序列设计、合成寡核苷酸链,构建重组慢病毒穿梭质粒,其PCR产物电泳结果为343 bp,空载体PCR产物306 bp;DNA测序显示pGCSIL-GFP-shRNA测序反应中断,但已显示部分插入序列。④转染后的293T细胞,生长良好,荧光表达强,慢病毒滴度为2×106TU/μl。结论:靶向小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒载体构建成功。

主 题 词：RNA干扰 慢病毒载体 巨噬细胞 肿瘤坏死因子-α 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100102[100102] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1000-484X.2014.07.014

馆 藏 号：203148873...