血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1的制备及在大鼠H9c2心肌细胞的转导

作     者：颜学滔 王焱林 王家宁 王成夭 何祥虎 YAN Xuetao;WANG Yanlin;WANG Jianing;WANG Chengyao;HE Xianghu

作者机构：武汉大学中南医院麻醉科湖北武汉430071 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(编号:30872426) 

出 版 物：《武汉大学学报（医学版）》 (Medical Journal of Wuhan University)

年 卷 期：2010年第31卷第4期

页      码：421-425,F0002页

摘      要：目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白PEP-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白PEP-1-HO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠H9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在H9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hHO-1 cDNA与pET15b-PEP-1重组成功,重组质粒pET15b-PEP-1-hHO-1经酶切鉴定含有hHO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透H9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-PEP-1-hHO-1原核表达质粒,获得了可穿透H9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1,为应用HO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。

主 题 词：血红素加氧酶-1 PEP-1肽 融合蛋白 蛋白转导 H9c2细胞 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100210[100210] 10[医学] 

D　O　I：10.14188/j.1671-8852.2010.04.001

馆 藏 号：203153286...