双靶向调控CDX2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

作     者：郑见宝 贺赛 孙学军 任燕飞 陈南征 张仕运 刘栋 张立 王晖 

作者机构：西安交通大学医学院第一附属医院普通外科陕西西安710061 西安交通大学医学院第二附属医院普通外科陕西西安710004 陕西省人民医院麻醉科陕西西安710068 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(项目编号:81101874 项目编号:81172362) 陕西省科学技术研究发展计划项目(项目编号:2011-K12-19) 陕西省科技统筹创新工程计划项目(项目编号:2013KTCQ03-08)~~ 

出 版 物：《中国普外基础与临床杂志》 (Chinese Journal of Bases and Clinics In General Surgery)

年 卷 期：2014年第21卷第4期

页      码：414-419页

摘      要：目的构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HREhTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果经PCR和测序分析,pLEGFP-5HREhTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。

主 题 词：缺氧 端粒酶 慢病毒载体 基因治疗 结直肠癌 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.7507/1007-9424.20140102

馆 藏 号：203153458...