小鼠Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

作     者：辛晨 况春燕 刘兴德 XIN Chen;KUANG Chunyan;LIU Xingde

作者机构：贵州医科大学附属人民医院心内科贵州贵阳550003 贵州省人民医院心内科贵州贵阳550003 贵州中医药大学心内科贵州贵阳550003 

基　　金：国家自然科学基金(81560056) 贵州省第十二批优秀青年科技人才项目(黔科合平台人才5662) 贵州省科技计划项目(黔科合基础1097) 贵州省留学人员科技活动择优资助项目(黔人项目资助合同0003号) 贵州省科技平台及人才团队计划项目(黔科合平台人才2017-5405) 

出 版 物：《贵州医科大学学报》 (Journal of Guizhou Medical University)

年 卷 期：2024年第49卷第11期

页      码：1593-1600页

摘      要：目的构建携带小鼠Schlafen3(Slfn3)基因的重组过表达质粒,并观察其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法从GenBank基因数据库获取小鼠Slfn3基因序列,利用VectorNTI软件对其进行引物设计,通过PCR扩增获得目的基因,将所得到的目的基因与穿梭载体pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-MCS-3xFLAG相连接,获得重组腺病毒载体pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG;筛选阳性克隆抽提质粒,通过限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并通过DNA测序验证;采用Admax系统将目的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒一同转染HEK293细胞获得重组腺病毒(Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG),对其进行病毒滴度测定,Western blot验证Slfn3蛋白的表达;体外培养小鼠脾源EPCs 5~7 d,细胞密度达70%后,用Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG进行转染48 h后,采用荧光显微镜观察并统计绿色荧光细胞数量,计算Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG转染的效率。结果DNA测序验证Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG构建成功,病毒滴度为3.16×1010(ifu/mL);腺病毒包装之后的重组腺病毒能够转染HEK293细胞,并在细胞中表达Slfn3-EGFP-3xFLAG融合蛋白,且含有Flag标签的蛋白,大小为57 kDa;重组腺病毒在EPCs中的转染效率为(71.43±2.58)%。结论成功地构建了小鼠Slfn3的过表达重组腺病毒载体,且在EPCs转染效率较高。

主 题 词：Schlafen3 内皮祖细胞 重组腺病毒 质粒 载体构建 基因过表达 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100201[100201] 10[医学] 

D　O　I：10.19367/j.cnki.2096-8388.2024.11.004

馆 藏 号：203155874...