抗酸染色阳性痰涂片刮削物扩增分枝杆菌rpoB基因的初步探索

作     者：童莉 孟繁荣 刘志辉 饶运帷 高俊文 牛群 雷杰 谭守勇 

作者机构：广州医科大学研究生510000 广州市胸科医院结核科.国家呼吸重点实验室510095 

基　　金：广东省科技计划项目(编号:2011B061300085) 广州市医药卫生科技重点项目(编号:201102A212009) 

出 版 物：《实用医学杂志》 (The Journal of Practical Medicine)

年 卷 期：2014年第30卷第11期

页      码：1811-1814页

摘      要：摘要目的：探讨直接从抗酸染色阳性痰涂片刮削物中扩增分枝杆菌rpoB基因的方法。方法：（1）使用引物Primerl：5’-CGTACGGTCGGCGAGCTGATC-3’，与Primer2：5’-AGGGGTITCGATCGGGCACATC-3’；Primer3：5’-TGqTCTICAAGGAGAAGCG-3’．与Primer4：5’-TCGTCGGCGGTCAGGTA-3’分别扩增18株临床分离结核分枝杆菌的rpoB基因，以检测引物设计的合理性。（2）分别采用普通PCR、TouchdownPCR、巢式PCR、二次PCR对直接从3＋～4＋抗酸染色痰涂片刮削物中提取的80例分枝杆菌基因组DNA进行rpoB基因扩增。（3）对80例抗酸染色痰涂片刮削物基因组DNA行实时荧光定量PCR以检测其拷贝数。（4）对18例临床分离菌株基因组DNA10^0、10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6、10^7倍稀释物行实时荧光定量PCR与普通PCR（Primerl与Primer2。Primer3与Primer4），以比较二者检出限。结果：（1）两对引物对18株临床分离结核杆菌rpoB基因扩增均有明亮目的条带，并经测序证实。（2）80例痰涂片刮削物基因组DNA扩增均未见目的奈带。（3）80例痰涂片刮削物基因组中．其中20例DNA的拷贝数为10z～10。copies／μL，60例DNA的拷贝数为10^4～10^5copies／μL。（4）两组引物能够扩增出rpoB基因的最高稀释倍数分别为10^4、10^5倍，其对应的荧光定量PCR检测拷贝数分别为10。copies／IxL、107copies／μL。结论：从抗酸染色阳性痰涂片刮削物中扩增分枝杆菌rpoB基因理论上可行，但在实际操作中尚存在-些问题有待进一步探索。抗酸染色涂片制作过程对基因提取及扩增的影响，痰涂片刮屑物基因组提取过程中多次离心造成的DNA量部分丢失均可能是本实验失败需要考虑的因素之-。

主 题 词：结核 痰涂片 rpoB基因 PCR 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100201[100201] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1006-5725.2014.11.043

馆 藏 号：203156539...