乙型肝炎病毒X蛋白激活基因1的克隆化与序列分析

作     者：刘妍 成军 王琳 王建军 陆荫英 李克 

作者机构：中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心 

基　　金：国家自然科学基金攻关项目 No.C03011402 No.C30070689 军队"九 五"科技攻关项目 No.98D063 军队回国留学人员启动基金项目 No.98H038 军队"十 五"科技攻关青年基金项目 No.010138 军队"十 五"科技攻关面上项目 No.01MB135 

出 版 物：《世界华人消化杂志》 (World Chinese Journal of Digestology)

年 卷 期：2003年第11卷第8期

页      码：1107-1113页

摘      要：目的:利用分子生物学技术,研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用,克隆HBxAg反式激活作用的靶基因,为进一步探索HBxAg的反式激活作用,以及反式激活作用的靶基因,阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制,为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础。方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBxAg的编码基因,构建表达载体pcDNA3.1(-)-X,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA,并进行抑制性消减杂交(SSH)分析。对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索,确认为与已知的功能基因无同源性之后,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,完成新基因序列的确定。然后自HepG2细胞提取总mRNA,应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物,进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果:PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列,经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误。转染HepG2细胞并提取足量的mRNA,利用SSH技术进行分析,获得的基因片段序列分析结果表明,其中之一为新型基因片段序列,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总mRNA,以RT-PCR技术,扩增获得该新基因的全基因序列,并测序证实,命名为XTP1,在GenBank中注册,注册号为AF488828。结论:利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1,并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。

主 题 词：乙型肝炎病毒 X蛋白 激活基因1 克隆 序列分析 反式激活 

学科分类：1007[医学-药学类] 100705[100705] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1009-3079.2003.08.007

馆 藏 号：203161274...