籽鹅卵泡颗粒细胞α-烯醇化酶基因RNA干扰表达质粒的构建及鉴定

作     者：张虹亮 计红 耿仁德 薛琳琳 杨焕民 王建发 司鸿飞 王慧 甘艺 

作者机构：黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江省农垦总局建三江分局勤得力农场第六管理区黑龙江同江156426 黑龙江职业学院黑龙江双城1501113 

基　　金：国家自然科学基金(31302052) 黑龙江省自然科学基金(C180103) 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2014年第27卷第4期

页      码：492-497页

摘      要：目的构建籽鹅卵泡颗粒细胞α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1)基因RNA干扰表达质粒,并进行鉴定。方法利用RNAi Designer等网络在线RNA干扰设计软件设计3条可能会干扰籽鹅卵泡颗粒细胞ENO1基因表达的插入DNA序列:shRNA-ENO1-350、shRNA-ENO1-892、shRNA-ENO1-591,将体外合成的3条干扰序列分别与线性化的pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建ENO1 RNA干扰表达质粒,在Lipofectamine 2000的介导下转染原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞,转染48 h后,荧光倒置显微镜下观察GFP的表达;实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染细胞中ENO1基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果 pGPU6/GFP/Neo-shDNA重组质粒经单酶切及测序证实构建正确;转染后48 h,转染重组质粒的颗粒细胞在荧光倒置显微镜下可见较强的绿色荧光,转染效率可达60%;与培养液组、转染试剂组和无关序列干扰组(shNC)相比,shRNA-ENO1-350组颗粒细胞中ENO1基因mRNA水平和蛋白表达水平均显著降低(P0.05)。结论成功构建了籽鹅卵泡颗粒细胞ENO1基因RNA干扰表达质粒,在原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞中,其表达量显著下降,为后续有关ENO1功能的研究奠定了基础。

主 题 词：α-烯醇化酶 RNA干扰 颗粒细胞 籽鹅 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13200/j.cnki.cjb.000251

馆 藏 号：203162677...