利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因

作     者：刘丹 邢培川 于文功 路新枝 

作者机构：中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室山东省糖科学与糖工程重点实验室山东青岛266003 

基　　金：国家自然科学基金项目(31070712 31000361) 国家高技术研究发展计划(863计划)(2011AA090703) 海洋公益性行业科研专项(201105027-3) 

出 版 物：《现代生物医学进展》 (Progress in Modern Biomedicine)

年 卷 期：2013年第13卷第1期

页      码：5-10页

摘      要：目的:新型琼胶酶基因的筛选。方法:根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析。将目的基因插入pET 24a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活。结果:获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas ***5。获得了一个新的基因,命名为agaD。agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa。序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89%和77%。重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 ***-1,说明该蛋白为琼胶酶。结论:采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具。

主 题 词：α-琼胶酶 单胞菌Thalassomonas SiteFinding PCR 兼并PCR 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 071010[071010] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13241/j.cnki.pmb.2013.01.002

馆 藏 号：203165496...