一种全长扩增克隆HEV方法和HEV体外瞬时转染体系的建立

作     者：信亮亮 李冰 荣义辉 Xin Liangliang;Li Bing;Rong Yihui

作者机构：通州区新华医院消化内科北京市101100 解放军第302医院肝脏肿瘤诊疗与研究中心 

出 版 物：《实用肝脏病杂志》 (Journal of Practical Hepatology)

年 卷 期：2016年第19卷第4期

页      码：423-427页

摘      要：目的建立HEV全长基因组扩增克隆和全长HEV RNA体外瞬时转染细胞方法和初步应用。方法取5例抗HEV IgG阳性患者血清,采用特异性引物逆转录HEV RNA为cDNA,设计通用的分段且相互重叠的PCR引物分步扩增,然后再分别将PCR产物进行重组PCR扩增,最终获得全长的HEV RNA cDNA产物片段。测序确定其序列,采用T-A克隆全长HEV cDNA序列,将HEV全长cDNA序列进行体外转录,提取转录后产物的RNA(去除DNA模板),获得高水平的HEV RNA产物,采用脉冲电流转染HepG2细胞,转染后24 h、48 h和96 h观察细胞上清HEV抗原分泌和HEV RNA载量。结果自Gen Bank获得约300条HEV全长基因组序列,设计了分段重组PCR方法,快速获得了HEV基因组全长序列;T-A克隆HEV全长基因组测序分析其序列,体外转录制备高纯度的HEV mRNA,通过电转方式转入HepG2细胞,在较短时间内检测出HEV RNA,有效地评价了HEV的体外表型。HEV抗原要先于HEV RNA出现;体外实验显示Ⅰ型和Ⅳ型HEV复制能力无明显差别,都在转染后48 h达到峰值。结论建立的分段重组PCR法扩增HEV全长基因组,体外电转细胞系后分泌HEV RNA,为后续HEV分子病毒学和表型耐药研究提供了条件。

主 题 词：戊型肝炎病毒 HepG2细胞 全长扩增 瞬时转染 体外 

学科分类：1004[医学-公共卫生预防医学类] 100401[100401] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1672-5069.2016.04.010

馆 藏 号：203166111...