靶向TNF-α RNA干扰重组体的构建及序列分析

作     者：宋晓宇 李铁钢 于艳秋 张海鹏 SONG Xiao-yu;LI Tie-gang;YU Yan-qiu;ZHANG Hai-peng

作者机构：中国医科大学基础医学院病理生理教研室 中国医科大学附属盛京医院急诊科辽宁沈阳110001 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(No.30271444) 

出 版 物：《中国病理生理杂志》 (Chinese Journal of Pathophysiology)

年 卷 期：2009年第25卷第9期

页      码：1870-1872页

摘      要：目的:利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建质粒重组体,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。方法:原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,15%DMEM培养液调细胞浓度为2×107cells/L接种于6孔板,3 mL/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24 h后ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度、RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段克隆入质粒载体,转化DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析。结果:LPS刺激巨噬细胞24 h后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度较对照组下降最明显(P<0.05),达59.46%,TNF-α mRNA的表达较对照组被抑制了61.20%;将干扰序列1DNA序列克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列。结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-αmRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。

主 题 词：肿瘤坏死因子 RNA干扰 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.3321/j.issn:1000-4718.2009.09.041

馆 藏 号：203173422...