兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

作     者：梁博伟 潘新元 赵劲民 殷国前 胡峰 Liang Bo-wei;Pan Xin-yuan;Zhao Jin-min;Yin Guo-qian;Hu Feng

作者机构：广西医科大学第一附属医院创伤手外科广西壮族自治区南宁市530021 广西医科大学第一附属医院整形外科广西壮族自治区南宁市530021 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(30860285) 课题名称:早期激素性股骨头缺血性坏死的蛋白质组学动态分析~~ 

出 版 物：《中国组织工程研究》 (Chinese Journal of Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2012年第16卷第11期

页      码：1954-1958页

摘      要：背景:膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。目的:针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。方法:针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。

主 题 词：膜联蛋白A1 短发夹RNA 慢病毒载体 RNA 干扰 成骨细胞 

学科分类：0831[工学-公安技术类] 08[工学] 0836[0836] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.013

馆 藏 号：203180554...