基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

作     者：赵亚 李红武 师长宏 张彩勤 赵勇 刘佩娟 白冰 唐娟 白杰英 张海 无

作者机构：第四军医大学实验动物中心西安710032 北京艾德摩生物技术有限公司北京101111 第四军医大学细胞工程中心西安710032 军事医学科学院实验动物中心北京100071 

基　　金：军队重点研究课题(NO:BWS14J058) 国家自然科学基金面上项目(NO:81272385) 陕西省科技资源统筹项目(NO:2014FWPT-11) 

出 版 物：《中国实验动物学报》 (Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica)

年 卷 期：2016年第24卷第4期

页      码：339-343页

摘      要：目的应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成,sgRNA退火后克隆入p X330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠(F0)与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。

主 题 词：CRISPR/Cas9 基因敲除 免疫缺陷小鼠 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071002[071002] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.002

馆 藏 号：203188865...