重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因

作     者：叶程 邵坤彦 王亚南 覃桂 代风娇 何冬兰 

作者机构：中南民族大学生命科学学院湖北武汉430074 

基　　金：湖北省自然科学基金资助项目(2010CDZ046) 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2013年第26卷第5期

页      码：670-674页

摘      要：目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态*** DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。

主 题 词：谷氨酰胺转氨酶 重叠延伸聚合酶链反应 点突变 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 0831[工学-公安技术类] 1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0703[理学-化学类] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13200/j.cjb.2013.05.91.yech.014

馆 藏 号：203196445...