线粒体信号肽引导葡萄糖调节蛋白75-增强型绿色荧光蛋白(GRP75-EGFP)融合蛋白定位于线粒体

作     者：陈航 牛秀然 高嫒嫒 张思河 CHEN Hang NIU Xiuran GAO Aiai ZHANG Sihe

作者机构：南开大学医学院生物化学教研室天津300071 

基　　金：国家自然科学基金(81373318) 高等学校博士点专项科研基金(20130031120037) 天津市自然科学基金(16JCYBJC23900) 药物化学国家重点实验室开放基金(20130575) 

出 版 物：《细胞与分子免疫学杂志》 (Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology)

年 卷 期：2016年第32卷第10期

页      码：1311-1316页

摘      要：目的构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位。方法通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接。利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体。将上述重组基因克隆入p EGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染He La细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况。结果成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒。各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在He La细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期。EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于He La细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周。结论构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位。

主 题 词：葡萄糖调节蛋白75(GRP75) 线粒体靶向信号肽 重叠延伸PCR 亚细胞定位 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 1001[医学-基础医学] 100102[100102] 071007[071007] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13423/j.cnki.cjcmi.007907

馆 藏 号：203208338...