刚地弓形虫529 bp重复序列环介导等温扩增检测方法的建立

作     者：徐前明 袁恒青 赵长城 方芬 刘喆 宁红蕊 石大丽 李郁 王海洋 

作者机构：安徽农业大学动物科学技术学院合肥230036 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046 

基　　金：安徽省高等学校自然科学基金(No.030870360)~~ 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2016年第34卷第5期

页      码：444-447,450页

摘      要：目的 建立高效检测刚地弓形虫（Toxoplama gondii）的环介导等温扩增（LAMP）方法，为弓形虫病诊断提供新的技术手段。 方法 采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物，用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板，建立LAMP扩增反应，通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和MgSO4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、猪等孢球虫（Isospora suis）的基因组DNA和超纯水为对照，pMD-19T-529 bp重组质粒为模板，分别进行优化后的LAMP和PCR扩增，评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100 copies/ml，分别进行优化后的LAMP和PCR扩增，评价LAMP方法的灵敏性。 结果 设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示，最佳反应总体系为25 μl，其中，甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L，MgSO4最佳浓度为6 mmol/L；添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当，可使反应时间缩短30 min；最佳反应条件为63 ℃ 30 min，80 ℃ 3 min。特异性检测结果显示，所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段， 对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示，LAMP方法的最低检出值达103 copies/ml，效率为PCR扩增（104 copies/ml）的10倍。 结论 建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法，该法具有较好的特异性和灵敏性。

主 题 词：刚地弓形虫 529 bp重复序列 环介导扩增 建立 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

馆 藏 号：203208482...