应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

作     者：陈芳 张伟锋 赵俊丽 杨沛艳 马锐 夏海滨 CHEN Fang;ZHANG Weifeng;ZHAO Junli;YANG Peiyan;MA Rui;XIA Haibin

作者机构：陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室陕西西安710062 安康学院现代农业与生物科技学院陕西安康725000 

基　　金：国家自然科学基金(31470058) 陕西省科技厅资助项目(2012K19-02-03) 中央高校基金项目(GK201504009) 

出 版 物：《细胞与分子免疫学杂志》 (Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology)

年 卷 期：2016年第32卷第11期

页      码：1446-1452页

摘      要：目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的。首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2串联载体。然后将p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系。最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβHEK293细胞系(C3-6)进行检测。结果敲除Rev-erbβ基因的HEK293细胞系中均未检测到Rev-erbβmRNA和蛋白质的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了基因定点修饰和敲除的Rev-erbβ-/-HEK293细胞系,为Rev-erbβ的功能和作用机制研究提供有效工具。

主 题 词：CRISPR/Cas9 HEK 293细胞 Rev-erbβ 基因敲入 基因敲除 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 07[理学] 071008[071008] 100102[100102] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13423/j.cnki.cjcmi.007938

馆 藏 号：203208555...