基于CRISPR/Cas9系统构建精准调控Wnt信号通路的表达载体及其效果的验证

作     者：龚鱼湄 梁宏亮 韦梦影 刘向伟 杨国栋 杨新卫 GONG Yu-mei;LIANG Hong-liang;WEI Meng-ying;LIU Xiang-wei;YANG Guo-dong;YANG Xin-wei

作者机构：山西医科大学附属第一医院心胸外科山西太原030000 第四军医大学西京医院心血管外科陕西西安710032 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032 第四军医大学口腔医院种植科陕西西安710032 

基　　金：国家自然科学基金项目(31100979 81570232) 

出 版 物：《现代生物医学进展》 (Progress in Modern Biomedicine)

年 卷 期：2016年第16卷第31期

页      码：6031-6037页

摘      要：目的:构建基于CRISPR/cas9系统调控Wnt信号通路的载体,并在细胞水平验证其调控基因表达的效率。方法:选取Wnt信号中负性调控分子,设计并合成能够表达靶向上述分子gRNA的互补DNA克隆序列,BsmBI限制性内切酶酶切载体后,采用分子克隆的方法将上述序列克隆至目的载体lenti-sgRNA-Ms2-zeo,测序正确的克隆通过Lipofectamine2000与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同转染入293细胞;转染24h后收集细胞,qRt-PCR检测目的基因的表达。结果:筛选了Wnt信号通路中已知的19个负性调控基因;针对每个基因设计了两对gRNA序列,并构建了能够表达gRNA和MS2融合序列的载体,测序结果显示重组质粒的DNA序列与预期完全相符。随机挑选了4个表达载体与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共转进入细胞,qPCR结果显示构建的目的载体联合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine载体可以协同促进靶分子表达。结论:本研究成功构建了基于CRISPR/cas9基因编辑系统调控Wnt信号的载体。

主 题 词：CRISPR/cas9 gRNA 质粒重组 基因表达 Wnt信号通路 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 10[医学] 

D　O　I：10.13241/j.cnki.pmb.2016.31.008

馆 藏 号：203208675...