microRNA-133b过表达载体的构建及在Eca109细胞的表达鉴定

作     者：阿拉法特.卡哈尔 刘伊宁 加米拉.扎衣顿 库尔班江.托合提 廉思谊 伊力旦.热合曼 伊力扎提.艾买提江 李惠武 李卉 Arafat Kahar LIU Yining Jamila Zaydun Kurbanjan Tohti LIAN Siyi Ildan Rahman Elzat Amatjan LI Huiwu LI Hui

作者机构：新疆医科大学临床医学院 新疆医科大学基础医学院分子生物学教研室乌鲁木齐830011 新疆轻工学院化工分院有机化工教研室乌鲁木齐830000 新疆医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所乌鲁木齐830011 新疆医科大学中心实验室地方病分子生物学重点实验室乌鲁木齐830011 

基　　金：新疆医科大学大学生创新项目基金(201510760007) 国家自然科学基金(81460359) 

出 版 物：《新疆医科大学学报》 (Journal of Xinjiang Medical University)

年 卷 期：2017年第40卷第1期

页      码：66-70页

摘      要：目的构建携带Human Hsa-mir-133b基因的miRNA干扰慢病毒载体(pl KD-Ubc-e GFP-U6-shRNA),并成功转染食管癌Eca109细胞株。为研究微小RNA133b(miR-133b)对食管癌Eca109细胞的作用奠定基础。方法凭据Human Hsa-miR-133b基因的转录目录,设计shRNA的靶点并进行引物的合成。将单链的引物退火成带粘性末端的双链片段,将其衔接于双酶切的RNA干扰载体,替换原有的ccd B毒性基因,用重组的质粒转染感受态细胞,并测定序列。筛选出来的阳性克隆即为miR-133b的干扰载体质粒。提取测序结果准确的克隆里含有的载体质粒。将重组的载体质粒转染至食管癌Eca109细胞。结果成功构建了miR-133b干扰慢病毒载体,重组质粒进行PCR鉴定及序列测定证实DNA oligo成功连到载体中,并实现食管癌ECA109细胞中重组载体质粒的稳定转染。在荧光倒置显微镜下分别观察到重组空载体组转染的Eca109细胞和过表达载体组转染的Eca109细胞发出不同强度的带有绿色荧光的信号。结论该实验成功构建了人miR-133b基因的干扰慢病毒载体,采取脂质体法对食管癌Eca109细胞进行质粒转染,获得高表达,为进一步研究miR-133b的功能奠定牢固的基础。

主 题 词：RNA干扰 慢病毒 微小 RNA133b(miR-133b) DNA过表达载体 Eca109 细胞 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071009[071009] 09[农学] 0901[农学-植物生产类] 090102[090102] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1009-5551.2017.01.017

馆 藏 号：203210077...