罗氏沼虾野田村病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

作     者：黄光华 童桂香 黎小正 李旻 黄国秋 卢小花 陈静 吴明媛 韦信贤 

作者机构：广西水产科学研究院南宁530021 

基　　金：广西水产畜牧兽医局科技推广应用项目(桂渔牧科201452005 桂渔牧科201452037) 广西直属公益性科研院所基本科研业务费项目(GXIF-2012-08) 

出 版 物：《南方农业学报》 (Journal of Southern Agriculture)

年 卷 期：2015年第46卷第11期

页      码：2059-2063页

摘      要：【目的】建立一种检测罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV）的实时荧光定量RT-PCR,为防控罗氏沼虾白尾病（White tail disease,WTD）提供技术支持。【方法】将MrNV衣壳蛋白基因片段（***287005）克隆到pGM-T载体,选取阳性重组质粒用SalⅠ酶切获得线性化转录模板DNA,经体外转录获得标准品RNA;在MrNV基因序列的保守区域设计1对扩增片段为119 bp的特异性引物,以标准品RNA为模板进行引物浓度筛选及标准曲线制定,并对建立的检测方法进行标准曲线和融解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】建立的一步法实时荧光定量RT-PCR定量范围宽,检测模板范围在1×10~1~1×10~8拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系;融解曲线表现为单一波峰,Tm为81.17~81.25℃;扩增曲线呈明显的S形,以C_t值35.00为界限,灵敏度约为10个病毒粒子,是常规RT-PCR的1000倍。该方法仅对MrNV具有良好的特异性,其组内和组间试验的Ct值变异系数分别为0.15%~0.83%和0.56%~0.95%;对83份罗氏沼虾临床样品进行检测,其结果与套式RT-PCR的检测结果一致。【结论】针对MrNV检测建立的一步法实时荧光定量RT-PCR具有快速、便捷、灵敏、准确等优点,且对样品的检测范围宽,适用于MrNV隐性感染和发病诊断。

主 题 词：罗氏沼虾 野田村病毒 白尾病 一步法实时荧光定量RT-PCR 检测 

学科分类：0906[农学-水产类] 09[农学] 

D　O　I：10.3969/j:issn.2095-1191.2015.11.2059

馆 藏 号：203213008...