DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体制备及感染结肠癌RKO细胞的干扰效应

作     者：姜韬 马丽园 李海 马晓强 师新荣 彭志海 杨银学 JIANG Tao;MA Liyuan;LI Hai;MA Xiaoqiang;SHI Xinrong;PENG Zhihai;YANG Yinxue

作者机构：宁夏医科大学总医院结直肠外科银川750004 宁夏医科大学总医院超声科银川750004 上海交通大学附属第一人民医院普外科上海200080 

基　　金：国家自然科学基金(81460369) 宁夏自然科学基金(NZ15161) 宁夏回族自治区卫计委重点科研计划资助项目(2014-NW-011) 

出 版 物：《宁夏医科大学学报》 (Journal of Ningxia Medical University)

年 卷 期：2017年第39卷第1期

页      码：9-13,F0004页

摘      要：目的应用RNA干扰技术构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,感染结肠癌RKO细胞,观察其抑制DGKζ表达的效率。方法运用Real-time PCR及Western blot检测8株结肠癌细胞中DGKζ基因的表达。针对DGKζ基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA oligo,慢病毒载体酶切,转染备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染RKO细胞后,运用Real time PCR和Western blot法检测DGKζ基因的敲减效率。结果 8株结肠癌细胞株中,DGKζ在RKO细胞中的表达丰度最高,满足敲减要求;测序表明重组质粒构建成功;Real-time PCR实验结果显示,在RKO细胞中,相对于感染慢病毒空载体细胞,DGKζ基因的敲减效率均达到70%以上(P<0.05)。Western blot结果显示,RKO细胞和感染慢病毒空载体细胞(Negative control)在124k Da处出现免疫印迹,而干扰敲减DGKζ基因的细胞(sh RNA-DGKζ)则不表达内源性DGKζ蛋白,表明DGKζ基因慢病毒感染有很高的敲减效率。结论成功构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,进一步证实了感染结肠癌RKO细胞的特异性干扰效应。

主 题 词：结肠癌 DGKζ RNA干扰 慢病毒载体 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2017.01.003

馆 藏 号：203218793...