p27^(kip1)过表达慢病毒载体的构建与鉴定

作     者：朱丽红 姜霄晖 钊守凤 刘筱楠 ZHU Li-hong;JIANG Xiao-hui;ZHAO Shou-feng;LIU Xiao-nan

作者机构：潍坊医学院眼科学教研室山东潍坊261053 青岛市市立医院眼科中心 青岛市市立医院中心实验室 

出 版 物：《潍坊医学院学报》 (Acta Academiae Medicinae Weifang)

年 卷 期：2017年第39卷第4期

页      码：306-309,F0003页

摘      要：目的构建p27^(kip1)过表达慢病毒载体,观察其感染人晶状体上皮细胞系后p27^(kip1)的表达情况,为探讨p27^(kip1)基因转染治疗后发性白内障(PCO)提供实验基础。方法设计p27^(kip1)基因引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增制备p27^(kip1)基因片段。利用限制性内切酶消化慢病毒载体得到线性化的慢病毒载体。将目的基因扩增产物与线性化的慢病毒载体通过交换的方法进行重组反应,从而构建含目的基因的重组质粒,命名为GV308-p27^(kip1)。将GV308-p27^(kip1)加入感受态细菌进行转化,用PCR方法鉴定平板上的单克隆菌落,对阳性菌落抽提质粒并送公司测序。将阳性菌液扩大培养,抽提以得到高纯度的GV308-p27^(kip1),其与两种包装质粒一起共转染293T细胞,从而包装慢病毒。将重组慢病毒以优化感染滴度感染293T细胞和人晶状体上皮细胞,通过Western Blot检测p27^(kip1)的表达水平。结果对阳性转化子进行PCR鉴定及重组质粒DNA测序,证明GV308-p27^(kip1)构建成功。通过Western Blot检测,p27^(kip1)过表达慢病毒载体能明显提高293T细胞中p27^(kip1)的表达水平。p27^(kip1)过表达慢病毒载体可高效感染人晶状体上皮细胞并明显上调p27^(kip1)的表达。结论本方法成功构建了p27^(kip1)过表达慢病毒载体,并观察到p27^(kip1)在293T细胞及人晶状体上皮细胞的过表达,为进一步研究p27^(kip1)过表达对人晶状体上皮细胞生物学功能的影响及基因治疗PCO奠定了基础。

主 题 词：p27^kip1 慢病毒载体 后发性白内障 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100212[100212] 10[医学] 

D　O　I：10.16846/j.issn.1004-3101.2017.04.022

馆 藏 号：203233864...