利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究

作     者：孟令文 赵月蒙 夏惠 方强 张青锋 MENG Ling-wen;ZHAO Yue-meng;XIA Hui;FANG Qiang;ZHANG Qing-feng

作者机构：蚌埠医学院病原生物学教研室安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠233030 同济大学医学院上海200092 

基　　金：国家自然科学基金(No.81630063) 安徽高校科研创新平台团队项目(No.2016-40) 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2017年第35卷第3期

页      码：197-201页

摘      要：目的利用单链引导RNA(sg RNA)串联表达框架编辑恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)K13和NUP116基因。方法根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物,PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂,并引入突变位点。PCR串联基因K13和NUP116的sg RNA,将同源臂和串联的sg RNA与载体p L6cs连接,构建用于电击转染实验的载体p L6-K13-NUP116,将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法,转入恶性疟原虫体内,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统对基因进行编辑修饰,通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂(WR)和杀稻瘟菌素(BSD)筛选转基因疟原虫,提取转基因疟原虫的基因组,对其进行PCR检测,最终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰。结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂(K13全长557 bp,NUP116全长569 bp)以及串联的sg RNA,与载体p L6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体p L6-K13-NUP116。电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫,培养至第28天涂片镜检发现疟原虫。PCR检测结果显示,转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功。测序表明,K13和NUP116基因的目标位点被成功突变。结论基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sg RNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑。

主 题 词：恶性疟原虫 CRISPR/Cas9系统 基因编辑 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

馆 藏 号：203236986...