用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

作     者：吉元刚 张国利 李泽鸿 岳玉环 吴广谋 田园 刘雨玲 李玉洁 赵鑫 付玉和 王冬冬 张培培 侯天全 徐艳玲 马洪园 JI Yuan-gang ZHANG Guo-li LI Ze-hong YUE Yu-huan WU Guang-mou TIAN Yuan LIU Yu-ling LI Yu-jie ZHAO Xin FU Yu-he WANG Dong-dong ZHANG Pei-pei HOU Tian-quan XU Yan-ling MA Hong-yuan

作者机构：军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118 

基　　金：吉林省科技发展计划资助(20130206012yy) 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2017年第30卷第9期

页      码：901-905页

摘      要：目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在***中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态*** BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在***中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。

主 题 词：SNAP25-VAMP 绿色荧光蛋白 肉毒毒素活性 血清型 

学科分类：1007[医学-药学类] 100705[100705] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

D　O　I：10.13200/j.cnki.cjb.001785

馆 藏 号：203260476...