拓扑异构酶ⅡαRNA小分子干扰片段表达载体的构建与鉴定

作     者：何静 李力 张玮 黎丹戎 王琪 唐步坚 

作者机构：广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021 四川省肿瘤医院妇瘤科 

基　　金：广西卫生厅重点项目基金资助项目(No.200514) 

出 版 物：《广西医科大学学报》 (Journal of Guangxi Medical University)

年 卷 期：2009年第26卷第5期

页      码：690-693页

摘      要：目的:构建拓扑异构酶ⅡαRNA小分子干扰片段(TopoⅡαsiRNA)的真核表达载体并进行表达鉴定。方法:(1)根据GeneBank表达序列标签(Esr)数据库设计4对TopoⅡα基因siRNA的小分子片段。(2)采用RT-PCR方法检测细胞中的To-poⅡα表达并确定受试细胞。(3)将最佳沉默siRNA片段克隆到psilencer4.1-CMV-neo载体上,质粒DNA直接测序确定克隆成功。(4)采用脂质体法将TopoⅡα-siRNADNA转染至受试细胞。并采用有限稀释法和G418加压筛选并培养稳转及对照细胞。(5)分别采用RT-PCR和Westernblot方法测定稳转及对照细胞系TopoⅡαmRNA和蛋白表达。结果:(1)SKOV3/DDP细胞中TopoⅡαmRNA表达最高,与其亲本细胞SKOV3相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)以TopoⅡα-4302siRNA片段沉默TopoⅡαmRNA表达最强(P<0.01)。(3)重组阳性克隆经测序鉴定证实TopoⅡα-4302siRNA克隆成功。(4)RT-PCR和Westernblot检测结果显示转染TopoⅡα-4302siRNA质粒DNA后能抑制SKOV3/DDP细胞中的TopoⅡα基因表达。结论:成功构建psilencer4.1-CMV-neo-TopoⅡα-siRNA重组表达载体并稳转至SKOV3/DDP细胞系。为下一步探讨TopoⅡα基因在卵巢癌多药耐药中的作用提供了实验基础。

主 题 词：TopoⅡα基因 RNA干扰 真核表达 构建 卵巢癌 多药耐药 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1005-930X.2009.05.011

馆 藏 号：203271703...