人DNMT3A基因慢病毒载体构建及其乳腺癌细胞MDA-MB-231稳定表达株的建立

作     者：张慧变 王媛 于林 ZHANG Huibian;WANG Yuan;YU Lin

作者机构：天津医科大学天津300070 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(81672592 81202102) 

出 版 物：《山东医药》 (Shandong Medical Journal)

年 卷 期：2017年第57卷第42期

页      码：5-8页

摘      要：目的构建人类DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)蛋白过表达慢病毒载体并建立乳腺癌细胞MDA-MB-231稳定表达株。方法从乳腺癌细胞MDA-MB-231中提取总RNA,逆转录出含DNMT3A的c DNA;以DNMT3A的c DNA为模板,根据其CDS序列设计含有EcoRⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶位点的引物序列,采用PCR法扩增出带有双酶切位点的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Hyg中,获得重组的pLVX-FLAG-DNMT3A表达载体。重组的pLVX-FLAG-DNMT3A表达载体通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-DNMT3A的重组慢病毒。以慢病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h后在培养基中加入1μg/μL的嘌呤霉素,筛选出稳定表达DNMT3A蛋白的细胞株,检测稳定株及野生型细胞DNMT3A蛋白及mRNA表达水平。结果构建的重组质粒经菌落PCR、重组质粒双酶切、质粒PCR验证及测序比对鉴定正确。用病毒感染MDA-MB-231细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中,DNMT3A蛋白及mRNA表达水平分别为13.2±0.48、107.10±0.46,均高于野生型及空载对照。结论成功构建了DNMT3A基因慢病毒表达载体pLVX-FLAG-DNMT3A,并在MDA-MB-231细胞中筛选出稳定表达DNMT3A的细胞株,为进一步探讨DNMT3A在乳腺癌中的作用提供了体外细胞系模型。

主 题 词：DNMT3A基因 慢病毒载体 MDA-MB-231细胞 乳腺癌 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 071010[071010] 081704[081704] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-轻工类] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.002

馆 藏 号：203278605...