人microRNA149抑制表达慢病毒载体的构建及对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响

作     者：王佩佩 王道月 轩菡 陈振东 缪琳 

作者机构：安徽医科大学第二附属医院肿瘤科合肥230601 安徽医科大学第二附属医院科研部合肥230601 

基　　金：国家自然科学基金(编号:81101525) 

出 版 物：《安徽医科大学学报》 (Acta Universitatis Medicinalis Anhui)

年 卷 期：2017年第52卷第12期

页      码：1756-1763页

摘      要：目的构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响。方法由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体p BS-h U6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平。同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确。在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010TU/L。将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P<0.05)。MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P<0.001)。结论成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移。并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据。

主 题 词：miR-149 慢病毒载体 增殖 迁移 Mel-RM细胞 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.19405/j.cnki.issnl000-1492.2017.12.003

馆 藏 号：203280777...