Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

作     者：耿介 王超男 李少华 丁红梅 李慧 黄皑雪 李洁 李达 白琛俊 张坦 董洁 邵宁生 GENG Jie;WANG Chao-Nan;LI Shao-Hua;DING Hong-Mei;LI Hui;HUANG Ai-Xue;LI Jie;LI Da;BAI Chen-Jun;ZHANG Tan;DONG Jie;SHAO Ning-Sheng

作者机构：军事医学研究院军事认知与脑科学研究所北京100850 

基　　金：国家自然科学基金(81572846 31570817) 

出 版 物：《生物技术通讯》 (Letters in Biotechnology)

年 卷 期：2018年第29卷第2期

页      码：162-167页

摘      要：目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。

主 题 词：CRISPR/Cas9技术 基因敲除 Vasorin(VASN)基因 细胞增殖 细胞迁移 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1009-0002.2018.02.002

馆 藏 号：203285282...