CRISPR/Cas9介导的prmt3基因敲除对A549细胞的影响研究

作     者：朱跃 彭昌民 陈亚丽 杨晓明 裴华东 ZHU Yue;PENG Chang-rain;CHEN Ya-li;YANG Xiao-ming;PEI Hua-dong

作者机构：安徽医科大学研究生院合肥230032 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心国家蛋白质科学中心北京生命组学研究所北京102206 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(81572740) 

出 版 物：《军事医学》 (Military Medical Sciences)

年 卷 期：2018年第42卷第2期

页      码：119-123,157页

摘      要：目的利用CRISPR/Cas9技术,构建靶向精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)的基因编辑质粒,建立prmt3基因稳定敲除的A549细胞株,检验prmt3基因敲除效率及其对A549细胞增殖的影响。方法设计靶向prmt3基因的sgRNA序列,将合成的片段克隆到CRISPR/Cas9质粒载体Lenti CRISPR中,挑取单克隆进行测序验证。将构建好的重组质粒和空载体分别进行慢病毒包装,并感染A549细胞,利用嘌罗霉素进行筛选获得PRMT3稳定敲除细胞株,Western印迹检测细胞中PRMT3蛋白的敲除效率。将敲除PRMT3的A549细胞进行单克隆分选,分别利用平板克隆形成实验检测PRMT3敲除后细胞增殖能力,平板划痕实验检测其迁移能力,流式细胞技术检测细胞周期的变化,质谱进行蛋白质组学分析,初步筛查PRMT3可能的底物。结果经测序验证,成功构建了靶向prmt3基因的Lenti CRISPR-PRMT3-sgRNA质粒。经Western印迹检测,A549 PRMT3敲除株中PRMT3的蛋白表达水平明显降低。经单克隆分选,成功获得PRMT3完全敲除的A549细胞株。PRMT3敲除导致A549细胞的克隆形成能力明显增强,细胞迁移能力不变,细胞周期发生G2/M期阻滞。进一步用蛋白质组学的方法初步鉴定了PRMT3可能的底物。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PRMT3稳定敲除的A549细胞株,发现PRMT3能调控细胞周期和增殖,并对其分子机制做了初步探索。

主 题 词：PRMT3 CRISPR/Cas9 非小细胞肺癌 增殖细胞 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.7644/j.issn.1674-9960.2018.02.009

馆 藏 号：203289152...