家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

作     者：朱文恺 甘泉 贺伟 张新伟 周跃 吴梦雪 孙同同 江松 孟艳 ZHU Wen-Kai;GAN Quan;HE Wei;ZHANG Xin-Wei;ZHOU Yue;WU Meng-Xue;SUN Tong-Tong;JIANG Song;MENG Yan

作者机构：安徽农业大学生命科学学院合肥230036 安徽省蚕桑资源利用国际联合研发中心合肥230036 

基　　金：国家自然科学基金项目(31172270) 国家级大学生创新训练项目(201610364026) 安徽省国际科技合作项目(1503062033) 

出 版 物：《应用昆虫学报》 (Chinese Journal of Applied Entomology)

年 卷 期：2018年第55卷第2期

页      码：208-216页

摘      要：【目的】CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G_0代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G_1代蚕种。【结果】PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据Ds Red2红色蛋白的荧光标记,从G_1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。

主 题 词：CRISPR/Cas9 基因编辑 sgRNA 家蚕 β-呋喃果糖苷酶 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 090504[090504] 07[理学] 08[工学] 0905[农学-林学类] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.7679/j.issn.2095-1353.2018.029

馆 藏 号：203289221...