利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系

作     者：方佳萍 赵秀娟 齐艳 王玺 吴旭东 娄建石 FANG Jiaping;ZHAO Xiujuan;QI Yan;WANG Xi;WU Xudong;LOU Jianshi

作者机构：天津医科大学基础医学院药理学教研室300070 天津市和平区小白楼街社区卫生服务中心 天津医科大学基础医学院细胞生物学系 天津医科大学眼科医院 

基　　金：973国家重点基础研究发展计划--组蛋白甲基化酶调控NK细胞功能的机制与结构研究(2014CB910104) 天津市高等学校科技发展基金计划项目(093-201301) 

出 版 物：《天津医药》 (Tianjin Medical Journal)

年 卷 期：2015年第43卷第10期

页      码：1104-1107,1219页

摘      要：目的利用CRISPR/Cas9n系统在NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2基因第5个外显子的小向导RNA(sg RNA),分别克隆进p X462载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3细胞中,利用有限稀释法得到单细胞,通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA,ge-notyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序。利用Western blot方法检测细胞株中Asxl2的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒。将2个重组质粒共转染NIH3T3细胞,嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系,并且经genotyping PCR测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot证实敲除Asxl2后,该NIH3T3细胞系中Asxl2蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒及稳定敲除Asxl2的NIH3T3细胞系。

主 题 词：ASXL2 CRISPR/Cas9n CRISPR系统 表观遗传 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.005

馆 藏 号：203289835...