利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株

作     者：刘思念 栾靖旸 张彦 曹观华 曹广进 李凌 LIU Si-nian;LUAN Jing-yang;ZHANG Yan;CAO Guan-hua;CAO Guang-jin;LI Ling

作者机构：南方医科大学公共卫生学院3级生物安全实验室广州510515 南方医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室广州510515 

基　　金：国家自然科学基金(81272407) 

出 版 物：《解剖学报》 (Acta Anatomica Sinica)

年 卷 期：2018年第49卷第3期

页      码：303-308页

摘      要：目的利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用Lenti CRISPRv2作为载体构建Lenti CRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒。收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。结果 Lenti CRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达。结论通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株。

主 题 词：CRISPR/Cas9 基因敲除 CXCR4 4T1细胞 实时定量聚合酶链反应 免疫印迹法 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.16098/j.issn.0529-1356.2018.03.006

馆 藏 号：203289906...