人CTGF和TIMP1基因重组腺相关病毒双表达质粒的构建及其活性检测

作     者：魏见伟 王德春 胡有谷 WEI Jian-wei;WANG De-chun;HU You-gu

作者机构：青岛大学医学院附属医院脊柱外科-山东省创伤骨科研究所青岛266003 

基　　金：国家自然科学基金项目(30471750) 

出 版 物：《复旦学报（医学版）》 (Fudan University Journal of Medical Sciences)

年 卷 期：2008年第35卷第3期

页      码：401-406页

摘      要：目的构建人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TI MP1)基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)表达质粒,并观察其在HEK293细胞中的表达,检测目的蛋白的生物学活性。方法采用PCR技术,分别设计引物扩增所需序列并进行PCR鉴定。再采用分子克隆的方法,以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)序列连接CTGF和TI MP1并克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TI MP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用双重免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性,ELISA法检测细胞培养上清液中TI MP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的CTGF和TI MP1基因序列的AAV表达质粒。双重免疫荧光和Western blot检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性,ELISA法结果证实重组载体能够高表达TI MP1蛋白。结论成功构建了双表达质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TI MP1,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的目的蛋白,为基因治疗椎间盘退变的研究工作奠定了基础。

主 题 词：结缔组织生长因子 基质金属蛋白酶组织抑制剂1 基因载体 腺相关病毒 椎间盘 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 07[理学] 100210[100210] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1672-8467.2008.03.018

馆 藏 号：203295629...