低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

作     者：哈小琴 姜东红 邓芝云 董菊子 赵勇 彭俊华 杨志华 HA Xiaoqin;JIANG Donghong;DENG Zhiyun;DONG Juzi;ZHAO Yong;PENG Junhua;YANG Zhihua

作者机构：兰州军区兰州总医院检验医学中心甘肃省干细胞与基因药物重点实验室甘肃兰州730050 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(81060015 81273568) 

出 版 物：《浙江大学学报（医学版）》 (Journal of Zhejiang University(Medical Sciences))

年 卷 期：2013年第42卷第6期

页      码：654-659页

摘      要：目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86)ng/mL。结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFPHIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。

主 题 词：低氧诱导因子一1仅 遗传载体 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.3785/j.issn.1008-9292.2013.06.011

馆 藏 号：203304366...