山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建

作     者：陶英杰 刘凤娟 毕春晓 任雪冰 曲瑞红 李科友 徐全乐 TAO Yingjie;LIU Fengjuan;BI Chunxiao;REN QU Ruihong;LI Keyou;XU Quanle

作者机构：西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100 

基　　金：国家自然科学基金项目(31401910) 中国博士后科学基金面上项目(2016M590975) 陕西省博士后科研项目(2016BSHEDZZ119) 中央高校基本科研业务费资助项目(2014YB040) 

出 版 物：《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 (Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition))

年 卷 期：2018年第46卷第8期

页      码：23-28,38页

摘      要：【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。

主 题 词：山黧豆 CASase基因 基因克隆 载体构建 CRISPR/Cas9系统 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10. 13207/j. cnki. jnwafu. 2018.08. 004

馆 藏 号：203304827...