成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性

作     者：赖永平 曾金华 谭雄红 柯坤 赵必星 Lai Yongping, Zeng Jinhua, Tan Xionghong, Ke Kun, Zhao Bixing

作者机构：福建医科大学孟超肝胆医院肝胆胰外科福州350025 福建医科大学孟超肝胆技术联合创新重点实验室福州350025 

基　　金：国家自然科学基金(81672376) 福建省医学创新课题(2016-CX-48) 福建省自然科学基金(2016J01417) 福州市卫生计生科技计划项目(2017-S-wt2) 

出 版 物：《中华实验外科杂志》 (Chinese Journal of Experimental Surgery)

年 卷 期：2018年第35卷第8期

页      码：1437-1440页

摘      要：目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。

主 题 词：成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术 293T细胞 Ku80基因 阿霉素 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2018.08.014

馆 藏 号：203330786...