重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用

作     者：赵薇 张昭 黄同列 穆楠 田菲 张伟 

作者机构：第四军医大学药学系生物制药学教研室陕西西安710032 宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系宁夏银川750004 第四军医大学基础部教学实验中心陕西西安710032 

基　　金：国家自然科学基金(81260460 81302560 81273279 81373201) 宁夏医科大学特殊人才启动项目(XT2012005) 陕西省自然科学基金(2012K-03-05) 

出 版 物：《细胞与分子免疫学杂志》 (Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology)

年 卷 期：2015年第31卷第9期

页      码：1234-1237页

摘      要：目的构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),检测其自主磷酸化水平。方法设计Fc DDR2克隆引物,以质粒pSec Tag2B-Fc DDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的c DNA序列(Fc DDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中。PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白Fc DDR2的表达效率。将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀`pFLAG-CMV2-Fc DDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价Fc DDR2的自主磷酸化能力。结果重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确。Western blot结果提示pFLAG-CMV2-Fc DDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-Fc DDR2表达水平显著上调。免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当。结论成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,Fc DDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式。

主 题 词：重组质粒 FcDDR2 HEK293T细胞 胶原刺激 磷酸化 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100102[100102] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13423/j.cnki.cjcmi.007459

馆 藏 号：203357594...