鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立

作     者：王亚文 惠凌云 张琳 冯艾 王威 马列婷 王全颖 杨广笑 刘正稳 

作者机构：西安交通大学医学院第一附属医院检验科西安710061 西安交通大学医学院第一附属医院感染科西安710061 西安华广生物工程公司西安710025 

基　　金：国家自然科学基金资助 项目批准号:81101260 

出 版 物：《现代检验医学杂志》 (Journal of Modern Laboratory Medicine)

年 卷 期：2014年第29卷第4期

页      码：1-4,172页

摘      要：目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X＋48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid *** cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.

主 题 词：鸭乙肝病毒 cccDNA 实时荧光定量PCR 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 071010[071010] 081704[081704] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-轻工类] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1671-7414.2014.04.001

馆 藏 号：203366414...