重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与免疫保护力评价

作     者：杜吉革 朱真 薛麒 赵俊杰 彭小兵 张秀坤 李启红 印春生 姚文生 康凯 陈小云 DU Ji-ge;ZHU Zhen;XUE Qi;ZHAO Jun-jie;PENG Xiao-bing;ZHANG Xiu-kun;LI Qi-hong;YIN Chun-sheng;YAO Wen-sheng;KANG Kai;CHEN Xiao-yun

作者机构：中国兽医药品监察所北京100081 

基　　金：科技部十三五"牛羊重要疫病免疫防控新技术研究"重点专项课题(2017WFD0500903) 

出 版 物：《中国兽药杂志》 (Chinese Journal of Veterinary Drug)

年 卷 期：2018年第52卷第9期

页      码：1-8页

摘      要：为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变。此外,在该基因5 端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNCPAm4。将GTFNCPAm4克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_NCPA_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_NCPA_(m4)与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价。二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTF_NCPA_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rTF_NCPA_(m4)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTF_NCPA_(m4)无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTF_NCPA_(m4)对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据。

主 题 词：A型产气荚膜梭菌CPA 突变 Th细胞表位 鞭毛蛋白 重组表达 毒力 抗原性 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.11751/ISSN.1002-1280.2018.09.01

馆 藏 号：203369192...