从江香猪PHKG2基因超表达载体和RNA干扰载体的构建及其表达

作     者：王圆圆 许厚强 陈伟 周迪 张鸣 杨涛 WANG Yuan-yuan;XU Hou-qiang;CHEN Wei;ZHOU Di;ZHANG Ming;YANG Tao

作者机构：贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵阳550025 贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州大学生命科学学院贵阳550025 

基　　金：国家科技支撑计划(2015BAD03B02-3) 黔科合重大专项(黔科合NY字6008号) 

出 版 物：《畜牧兽医学报》 (ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA)

年 卷 期：2018年第49卷第9期

页      码：1818-1829页

摘      要：旨在克隆从江香猪磷酸化酶激酶γ2(phosphorylase kinase gamma 2,PHKG2)基因编码区,并对PHKG2基因功能进行初步探究。本研究利用RT-PCR法扩增从江香猪PHKG2基因完整CDS区。通过构建pEGFP-N3-PHKG2超表达载体,设计并合成4对针对从江香猪PHKG2基因的RNAi表达载体,瞬时转染至C2C12细胞株和从江香猪肾细胞中,以正常生长的细胞为空白对照,24h后检测各个重组载体的绿色荧光蛋白的表达情况。48h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测目的基因PHKG2和糖原代谢相关基因糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)、肌肉糖原合成酶(glycogen synthase 1(muscle),GYS1)、磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyce rate mutase,PGAM2)基因mRNA的表达情况,并且测定各组细胞中的糖原含量。结果表明,经过双酶切、测序检测以及脂质体瞬时转染至C2C12细胞中,验证超表达载体pEGFP-N3-PHKG2和4对RNAi表达载体均构建成功。转染至从江香猪肾细胞后,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(pEGFP-N3),超表达载体pEGFP-N3-PHKG2能极显著提高PHKG2基因的表达量(P<0.01),同时显著上调PGAM2、PYGM基因的表达量(P<0.05),并且显著降低细胞中糖原的含量(P<0.05)。各RNAi载体中,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(NC),shRNA-1的干扰效率较高,极显著下调PHKG2基因的表达量(P<0.01),显著下调PGAM2、PYGM、GYS1基因的表达量(P<0.05),并且显著升高细胞中糖原含量(P<0.05)。shRNA-2极显著下调PHKG2基因的表达量(P<0.01);shRNA-3对PHKG2基因的表达也能起到显著的干扰作用(P<0.05);shRNA-4对于所检测的4个基因干扰效果不明显;shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4转染细胞后,细胞中糖原含量升高水平不明显。PHKG2基因超表达和RNAi后可分别明显上调和抑制PHKG2、PYGM、PGAM2、GYS1基因的表达,并且分别降低和提高糖原含量,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步研究PHKG2基因在细胞糖原代谢通路中的作用机制奠定基础。

主 题 词：从江香猪 PHKG2基因 超表达 RNA干扰 

学科分类：0905[农学-林学类] 09[农学] 090501[090501] 

核心收录：

D　O　I：10.11843/j.issn.0366-6964.2018.09.003

馆 藏 号：203369606...