sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

作     者：刘伟 王杰 幸永明 李纯志 陈昌伟 赵宏 龚德军 Liu Wei;Wang Jie;Xing Yong-ming;Li Chun-zhi;Chen Chang-wei;Zhao Hong;Gong De-jun

作者机构：解放军第113医院骨科浙江省宁波市315040 解放军第二军医大学附属长海医院胸心外科实验室上海市200433 

基　　金：南京军区医学科技创新重点课题(12Z06) 课题名称:LMP-1和SOX9共修饰BMSCs后复合血小板凝胶生物支架构建组织工程髓核的实验研究 

出 版 物：《中国组织工程研究》 (Chinese Journal of Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2014年第18卷第50期

页      码：8054-8060页

摘      要：背景:与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的:构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法:双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP),以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论:测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。

主 题 词：干细胞 间质干细胞 慢病毒感染 sox9转录因子 骨髓干细胞 慢病毒 sox9基因 LMP1基因 椎间盘 髓核细胞 共转染 组织工程 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071007[071007] 

D　O　I：10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.004

馆 藏 号：203373055...